單克隆抗體(MAb)是針專(zhuān)一的抗原決定簇產(chǎn)生的抗體，單克隆技術(shù)又名雜交瘤技術(shù)起源于1975年，由G.K?hler和Milstein創(chuàng )立。主要原理是利用產(chǎn)生抗體的B細胞與腫瘤細胞雜交融合成雜交瘤細胞，生產(chǎn)抗體。單克隆抗體制備過(guò)程有以下幾個(gè)步驟，下面講簡(jiǎn)要介紹。
1、免疫動(dòng)物 免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞的 過(guò)程。 一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細胞。
2、細胞融合 采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將準備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。
3、選擇性培養 選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般采用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長(cháng)期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無(wú)限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。
4、雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化 在HAT培養基中生長(cháng)的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細胞，并進(jìn)行克隆擴增。經(jīng)過(guò)全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類(lèi)型、亞類(lèi)、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。
5、單克隆抗體的大量制備 單克隆抗體的大量制備重要采用動(dòng)物體內誘生法和體外培養法。
(1)體內誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預處理。1-2周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
(2)體外培養法 將雜交瘤細胞置于培養瓶中進(jìn)行培養。在培養過(guò)程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來(lái)，各種新型培養技術(shù)和裝置不斷出現，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。雜交瘤細胞融合后，要進(jìn)行篩選后才能使用。雜交瘤細胞分為兩次：一、篩選出雜交瘤細胞;二、在初選的雜交瘤細胞中篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜家瘤細胞，這兩次篩選的方法和原理各不相同。
以上五個(gè)步驟簡(jiǎn)要概述了單克隆抗體制備過(guò)程。下面再介紹一下單克隆抗體的實(shí)驗原理。要制備單克隆抗體需先獲得能合成專(zhuān)一性抗體的單克隆B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長(cháng)。而實(shí)驗發(fā)現骨髓瘤細胞可在體外生長(cháng)繁殖，應用細胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性，它既具有B淋巴細胞合成專(zhuān)一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細胞培養增殖的細胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。
