克隆的時(shí)間一般說(shuō)來(lái)越早越好。因為在這個(gè)時(shí)期各種雜交瘤細胞同時(shí)旺盛生長(cháng)，互相爭奪營(yíng)養和空間，而產(chǎn)生抗體的細胞有被淹沒(méi)和淘汰的可能。但克隆時(shí)間也不宜太早，太早細胞性狀不穩定，數量少也易丟失。
克隆化的陽(yáng)性雜交瘤細胞，經(jīng)過(guò)一段時(shí)期培養之后，也還會(huì )因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產(chǎn)生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養?？寺』螖档亩嗌儆煞置谀芰娙鹾涂乖拿庖咝詮娙醵鴽Q定。一般說(shuō)，免疫性強的抗原克隆次數可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩定。
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借助撒在軟瓊脂上單個(gè)細胞定位生長(cháng)，而達到克隆化，具體操作如下：
1．配2.5％的瓊脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。
2．將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合，置45℃水浴預熱。
3．將瓊脂糖與DMEM液混合，即為含0.5％瓊脂糖的*DMEM液，并加75×108 脾細胞。
4．每塊平皿加10ml，于室溫中凝固。
5．DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合，將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上，使其全部覆蓋。
6．放入CO2箱飽和濕度，37℃培養10天。
7．用PBS配制0.6％瓊脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保溫情況下取一試管，迅速加入0.1ml 25％羊紅血球，0.2ml豚鼠補體，2.7ml 0.6％瓊脂糖。
8．用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍，可篩選抗羊紅血球Ig。
?。ǘ╋@微鏡操作法
在直徑6cm培養皿中，加入1ml 1.0×108細胞懸液放置5％CO2飽和濕度，37℃溫箱中放置30min以上，倒置顯微鏡下，尋找那些與周?chē)嗑嗌踹h的單個(gè)細胞，將毛細管口（一頭有直角彎頭毛細管，一頭連接一尺長(cháng)乳膠管，用口控制液體進(jìn)入）水平置放于液面上，左右微動(dòng)，直到看見(jiàn)管口，對準細胞，吸入毛細管，將管中細胞移到預先加有2.0×104~5.0×104飼養細胞96孔板內，培養后，即可獲得單個(gè)細胞形成的克隆。
?。ㄈ晒饧せ罘蛛x法
用一種熒光激活細胞分類(lèi)器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：將細胞經(jīng)熒光抗體染色后，經(jīng)噴嘴形成單個(gè)細胞的線(xiàn)形液滴，在萊塞光激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號由光電倍增管接收，再結合細胞形態(tài)大小產(chǎn)生光散射信號，經(jīng)電腦處理，產(chǎn)生信號并與預定的信號對比，根據細胞熒光強度及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場(chǎng)中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。
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1．材料
?。?）微量培養盤(pán)，盤(pán)內各孔于克隆化前一天培養小鼠腹腔細胞（即飼養細胞）每孔2萬(wàn)～4萬(wàn)。
?。?）HT培養基
2．操作方法
?。?）取出抗體陽(yáng)性孔細胞，用HT培養液制成細胞懸液。并取樣進(jìn)行臺盼蘭染色，計數。
?。?）用HT培養液將細胞稀釋成200個(gè)/ml、40個(gè)/ml、20個(gè)/ml和的懸液。
?。?）用吸管將細胞懸液分別種入微量培養盤(pán)，每孔0.05ml，細胞含量分別為10個(gè)/孔、2個(gè)/孔、1個(gè)/孔和0.5個(gè)/孔。
?。?）5％CO2飽和濕度，37℃培養。
?。?）每天用倒置顯微鏡觀(guān)察克隆生長(cháng)情況，選擇只有一個(gè)集落生長(cháng)的孔，棄掉兩個(gè)以上和沒(méi)有細胞生長(cháng)的孔。
?。?）克隆大量繁殖后，布滿(mǎn)孔底的1/3～1/2時(shí)，測培養液抗體。
?。?）抗體陽(yáng)性孔細胞，移到有飼養層的組織培養瓶中，并傳2～4代就可以脫離飼養細胞，建成克隆株。
